DNA – Estrutura e Replicação

Cromossomos e Genes

      O cromossomo é uma molécula complexa basicamente constituída de DNA ou ADN (ácido desoxirribonucléico) e proteínas. O DNA é uma longa molécula, formada por um polímero de nucleotídeos, contém as informações genética codificada que são transmitidas de geração a geração e também as informações necessárias ao desenvolvimento e a manutenção da vida dos organismos.

Figura 01: Cromossomos humano (figura disponível no site http://bit.fmrp.usp.br/ctc/cursoFerias/palestras/Organizacao_do_Genoma_Humano.ppt).

      Inicialmente, pesanva-se que eram as proteínas que possuíam o material genético. A partir da metade do século XX ficou comprovado que é o DNA que contém as informações que são transmitidas à outras gerações, como também, que as proteínas são sintetizadas no interior da células expressando informações obtidas do DNA.

Figura 02: Dos genes às proteínas (PORTO,2003).


      Nas células procarióticas, o cromossomo é uma única molécula de um ácido nucléico, denominado ácido desoxirribonucléico, o DNA.

      Nas células eucarióticas, o cromossomo é formado por DNA associado a pequenas moléculas de proteínas denominadas histona. É na molécula de DNA que estão contidos os genes, responsáveis pelo comando da atividade celular e pelas características hereditárias. Cada molécula de DNA contém vários genes dispostos linearmente ao longo da molécula. Cada gene, quando em atividade, é transcrito em moléculas de outros ácidos nucléicos denominados ácidos ribonucléicos (RNA), que comandarão a síntese de proteínas.

      Nas células procarióticas, os cromossomos encontram-se imersos no próprio citoplasma formando uma estrutura denominada nucleóide. Nas células eucarióticas os cromossomos encontram-se separados dos citoplasmas pela membrana nuclear ou carioteca, em uma estrutura denominada núcleo. A presença de membrana nuclear é uma característica típica das células eucarióticas, que as distingue das procarióticas. Além disso, as células procarióticas não apresentam organelas membranosas, como ocorre com as eucarióticas (http://www.biomania.com.br/citogenetica/odna.php, acessado em 30/06/03).

Figura 03: Genoma humano (figura disponível no site http://bit.fmrp.usp.br/ctc/cursoFerias/palestras/Organizacao_do_Genoma_Humano.ppt, acessado em 26/06/03).

 

Estrutura do DNA

Nucleotídeos

      Os nucleotídeos são elementos indispensáveis a sobrevivência das células, e são as unidades básicas dos ácidos nucléicos, deles dependem a produção de DNA e RNA e conseqüentemente a síntese de proteínas. São constituídos das seguintes moléculas:

- uma base nitrogenada (carbono e nitrogênio);
- uma pentose (açúcar com cinco carbonos);
- um grupo fosfato.

Figura 04: O nucleotídeo (figura disponível no site www.biomania.com.br/citogenética/odna.php, acessado em 30/06/2003).

      As bases nitrogenadas são de dois tipos: as purinas e as pirimidinas. As purinas são Adenina (A) e Guanina (G) e as pirimidinas são Timina (T), Citosina (C) e Uracil (U). É a presença dos átomos de nitrogênio que confere a estas moléculas sua característica básica.


Figura 05: As bases nitrogenadas Purinas e Pirimidas. Os números identificam a posição dos anéis heterocíclicos (mais de uma espécie de átomo). As purinas são numeradas de 1 a 9 e as pirimidinas de 1 a 6.

      A ligação entre a base nitrogenada e a pentose é feita covalentemente através de uma ligação N-glicosídica com a hidroxila ligada ao carbono-1 da pentose.

Figura 06: A ligação entre a base nitrogenada e a pentose (figura disponível no site www.biomania.com.br/citogenética/odna.php, acessado em 30/06/2003).

      A pentose é o elo de ligação entre a base nitrogenada e o grupo fosfato. A ligação entre o grupo fosfato e a pentose é feita através de uma ligação fosfoéster com a hidroxila ligada ao carbono-5 da pentose.

Figura 07: A ligação entre a pentose e grupo fosfato (figura disponível no site www.biomania.com.br/citogenética/odna.php, acessado em 30/06/2003).

      Convencionalmente, os nitrogênios das bases nitrogenadas purinas são numeradas de 1 a 9 e das pirimidinas de 1 a 6. E os carbonos das pentoses são numerados de 1´ a 5´ para diferenciá-los.

      Ao carbono 1’ da pentose se liga o nitrogênio 1 das purinas ou nitrogênio 9 das pirimidinas. E o carbono 5’ do grupo carboxila da pentose participa da ligação fosfoéster com o grupo fosfato.

      Esta disposição dos nucleotídeos determina a direção de crescimento para a cadeia de DNA, em uma extremidade possui livre a hidroxila do carbono-5 da primeira pentose e na outra a hidroxila do carbono-3 da última pentose.

Figura 08: Direção do crescimento da cadeia (figura disponível no site www.biomania.com.br/citogenética/odna.php, acessado em 30/06/2003).


Ácidos Nucléicos

      Nos ácidos nucléicos estão as informações necessárias para sobrevivência de um ser vivo e de seus descendentes, são os armazenadores e transmissores da informação genética. Eles codificam informações que dirige o desenvolvimento de um organismo, podendo envolver a produção de bilhões de células, cada qual com sua especialidade e expressando somente as funções que lhes são requeridas para que realizem seu papel na manutenção do organismo (CHAMPE, 1996).

      Os ácidos nucléicos podem ser: ácido desoxirribonucléico (DNA) e ácido ribonucléico (RNA), pela presença ou ausência do grupo hidroxila no carbono-2’ da pentose dos nucleotídeos (CHAMPE, 1996).

      As pentoses nos ácidos nucléicos são: as ribose e as desoxiborribose, diferem uma das outras pela presença ou ausência do grupo hidroxila no carbono-2’ da pentose. É esta característica que denomina os ácidos nucléicos de RNA (ácido ribonucléico) e DNA. (ácido desoxirribonucléico).

 

Figura 09: DNA versus RNA. Diferem uma da outra pela presença ou ausência do grupo hidroxila no carbono-2’ da pentose.

      Os ácidos nucléicos, portanto, são polímeros lineares de nucleotídios conectados entre si via ligações covalentes denominadas ligações fosfodiéster.

Figura 10: Molécula de DNA. Polímero de nucleotídeos (figura disponível em http://bit.fmrp.usp.br/ctc/cursoFerias/palestras/Organizacao_do_Genoma_Humano.ppt, acessado em26/06/03).

      As ligações entre os nucleotídeos para a formação da molécula de DNA ou RNA são realizadas covalentemente por ligações fosfodiéster formando entre si pontes de fosfato. O grupo hidroxila do carbono-3’ da pentose do primeiro nucleotídeo se liga ao grupo fosfato ligado a hidroxila do carbono-5’ da pentose do segundo nucleotídeo através de uma ligação fosfodiéster.


Figura 11: A ligação fosfodiéster entre os nucleotídeos (figura disponível no site www.biomania.com.br/citogenética/odna.php, acessado em 30/06/2003).

 

A molécula de DNA

      A molécula de DNA está presente não somente nos cromossomos do núcleo dos organismos eucarióticos, como também na mitocôndria e nos cloroplastos de vegetais. As células procarióticas não possuem núcleo, possuem um cromossomo, e também pode ter DNA não cromossômico em forma de plasmídios. O DNA deve ser capaz não somente de se replicar de modo preciso, cada vez que a célula se divide, como também, fazer com que a informação seja expressa seletivamente. O RNA participa na expressão da informação genética armazenada no DNA (CHAMPE, 1996).

Figura 12: A estrutura da molécula de DNA. Desempacotamento do cromossomo para replicação ou transcrição do DNA (PORTO, 2003).

      Pesquisadores buscavam descobrir como funcionava o mecanismo de transmissão da informação genética e como as proteínas eram sintetizadas.

      Em 1944 os canadenses Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty , do Instituto Rockefeller (EUA), mostram que é o DNA, e não as proteínas, que é capaz de transformar bactérias não-patogênicas em patogênicas. Isso sugere que é o DNA que armazena a informação genética. O DNA é a molécula informacional.

      Em 1950, o austríaco Erwin Chargaff, descobre, nos Estados Unidos, uma relação quantitativa entre as bases nitrogenadas do DNA. A proporção (razão molar) entre adenina e timina é sempre igual, e o mesmo ocorre entre guanina e citosina. A relação de bases A=T e C=G é constante em DNA das mais variadas espécies e tecidos.

Figura 13: Erwin Chargaff (foto disponível no site http://bit.fmrp.usp.br/ctc/cursoFerias/palestras/Organizacao_do_Genoma_Humano.ppt, acessado em 26/06/03).

      Rosalin Franklin e Maurice Wilkins, em 1951, obtêm imagens de DNA de excelente qualidade, por difração de raios X, onde foi possível determinar a periodicidade regular que ocorria na molécula de DNA. A cada dez nucleotídeos uma distância de 34 Å, sendo que cada nucleotídeo tem 3,4 Å.

Figura 14: Foto de Rosalin Franklin e Maurice Wilkins e figuras da difração de raio X. (disponível no site http://bit.fmrp.usp.br/ctc/cursoFerias/palestras/Organizacao_do_Genoma_Humano.ppt, acessado em 26/06/03).


Modelo da dupla hélice de DNA

      Em 1953, o norte americano James Watson e o britânico Francis Crick, propuseram o modelo da dupla hélice antiparalela para a estrutura do DNA.

Figura 15: James Watson e Francis Crick. (foto disponível no site http://bit.fmrp.usp.br/ctc/cursoFerias/palestras/Organizacao_do_Genoma_Humano.ppt, acessado em 26/06/03).

      Watson e Crick elucidaram o modelo tridimensional para a molécula de DNA, modelo da dupla hélice, baseando-se nos seguintes estudos:

- na natureza química dos componentes do DNA;
- nas relações quantitativas entre as bases nitrogenadas descritas por Chargaff;
- nos dados de difração de Raio X obtidos por Rosalin Franklin e Maurice Wilkins.

      O modelo consiste de duas cadeias helicoidais de DNA, enroladas ao longo de um mesmo eixo, formando uma dupla hélice de sentido rotacional à direita, cuja duas fitas da hélice estão em direção oposta, ou seja, antiparalelas. Portanto, a orientação das duas fitas é antiparalela. Uma das fitas possui a direção no sentido 5’ à 3’, enquanto que a outra está no sentido 3’à 5’. Esta conformidade da estrutura do DNA e as interações hidrofóbicas que contribuem para a estabilidade da hélice determinam a seguinte forma para a estrutura da molécula:

- O grupo fosfato e o açúcar (parte hidrofílica) estão localizados na parte externa da molécula.
- As bases nitrogenadas (parte hidrofóbica) estão localizadas na parte interna da molécula.
- A relação espacial entre as duas fitas cria um fenda maior e uma fenda menor.

      Uma volta completa da hélice é de 10 nucleotídeos (34 Å). Cada nucleotídeo tem 3,4 Å ou 0.34 nm .



Figura 16: Modelo da fita dupla de DNA proposto por Watson e Crick. (figuras disponíveis no site http://bit.fmrp.usp.br/ctc/cursoFerias/palestras/Organizacao_do_Genoma_Humano.ppt, acessado em 26/06/03).

      O pareamento das bases de cada fita se dá de maneira padronizada, sempre uma purina com uma pirimidina, especificamente: adenina com timina e citosina com guanina. A proximidade destas bases possibilita a formação de pontes de hidrogênio, sendo que adenina forma duas pontes de hidrogênio com a timina e a citosina forma três pontes com a guanina.

      A dupla hélice é mantida unida por duas forças:

- Por pontes de hidrogênio formadas pelas bases complementares;
- Por interações hidrofóbicas, que forçam as bases a se "esconderem" dentro da dupla hélice.

      Estudos mostram que existem duas formas de DNA com a hélice girando para a direita, chamadas A-DNA e B-DNA, e uma forma que gira para a esquerda chamada Z-DNA. As diferenças entre as duas formam que giram para a direita está na distância necessária para fazer uma volta completa da hélice e no ângulo que as bases fazem com o eixo da hélice. A forma B-DNA possui a dupla hélice mais longa e mais fina e cada volta da hélice possui 10 pares de bases. A forma A-DNA possui a dupla hélice mais curta e mais grossa e cada volta da hélice possui 11 pares de bases. A forma Z-DNA possui o sentido de rotação para a esquerda e cada volta da hélice possui 12 pares de bases .

Figura 17: Pareamento entre as bases. As fitas são mantidas unidas por pontes de hidrogênio entre bases complementares, perpendicularmente ao eixo açúcar-fosfato de cada fita (figura disponível no site http://bit.fmrp.usp.br/ctc/cursoFerias/palestras/Organizacao_do_Genoma_Humano.ppt, acessado em26/06/03).

      A molécula de DNA possui duas cadeias, onde cada cadeia é um polímero linear constituído de unidades repetidas de quatro tipos de nucleotídeos (Adenina (A), Timina (T), Guanina (G) e Citosina (C). A complementaridade estrutural e as pontes de hidrogênio entre A – T e G – C, confere a semelhança das duas cadeias com a estrutura da dupla hélice. A informação genética é codificada pela seqüência de nucleotídeos que formam o polímero. E a partir de uma da seqüência de uma cadeia a outra cadeia pode ser determinada pela sua complementaridade. O modelo da dupla hélice de DNA foi fundamental para desvendar o mecanismo molecular da hereditariedade. A transmissão da informação genética é realização pela duplicação ou replicação da molécula de DNA, onde cada cadeia garante uma cópia correta das informações (KANEHISA, 2000).


Dogma Central da Biologia Molecular

      Os DNAs e as proteínas são macromoléculas que desempenham um papel chave na vida de uma célula. Tanto o DNA como as proteínas são polímeros de unidades repetidas. A informação genética está armazenada no DNA por uma seqüência de quatro tipos de nucleotídeos e a replicação do DNA é o mecanismo de transmissão da informação genética. Porém, são as proteínas que realizam as funções vitais da célula. Então é necessário que os quatros tipos de nucleotídeos sejam traduzidos para os vinte tipos de aminoácidos possíveis. Esta etapa é crucial para a expressão da informação genética. Existe um mecanismo celular que realiza a transcrição do DNA para RNA, gera um RNA a partir dos códigos do DNA, e posterior tradução para proteínas. Na tradução, um conjunto de três nucleotídeos, ou códon, é traduzido para um aminoácido os quais vão se unindo por ligações peptídicas para formarem uma proteína. Os quatros nucleotídeos combinados três a três produzem sessenta e quatro combinações possíveis. Portanto, como temos apenas 20 tipos de aminoácido, existem aminoácidos degenerados, ou seja, existem alguns aminoácidos que podem ser traduzidos por mais de uma seqüência de nucleotídeos. O fluxo de informação para gerar um RNA e do RNA uma proteína, juntamente com o fluxo da transmissão da informação do DNA para DNA, forma o dogma central da biologia molecular (KANEHISA, 2000).

      Baseado neste raciocínio, em 1958, Francis Crick afirma que a especificidade de um fragmento de DNA depende apenas da seqüência de suas bases e que essa seqüência é a chave para a disposição dos aminoácidos em uma proteína particular. Propõe, então, o Dogma Central da Biologia Molecular, afirmando que a molécula de DNA é utilizada como molde para se construir RNA o qual será molde para a síntese de proteínas, sendo que a informação contida na proteína não pode ser repassada para a construção de outra proteína nem para a construção de uma molécula de DNA ou RNA (http://www.biomania.com.br/citogenetica/odna.php, acessado em 30/06/03).


Figura 18: Dogma central da biologia molecular.

      Entretanto, a proposta original, foi ampliada nos últimos anos com a descoberta, em 1970, da enzima transcriptase reversa por Temin & Mizutani e por Baltimore de forma independente, que copia RNA para DNA. Ficou esclarecido, que é possível sintetizar DNA utilizando-se RNA como molde. Um pouco antes disto, por volta de 1965, Spiegelman & Haruna haviam demonstrado que o RNA também podia servir de molde para a síntese de outras moléculas de RNA. Isto foi possível devido ao isolamento da enzima replicase codificada por um vírus infeccioso cuja informação genética está contida numa molécula simples de RNA. Estes estudos permitiram que o dogma central se ampliasse sem, contudo, perder a unidirecionalidade, ou seja, do DNA às proteína (BONATO , 2003).

 

Figura 19: Dogma central da biologia molecular modificado.


Replicação do DNA

      Watson e Crick ao decifrarem a estrutura molecular do DNA demonstraram como a molécula se auto duplicava, propondo, então, que:

- cada uma das fitas serviria de molde para a síntese de uma fita complementar;

- a seqüência dos pares de nucleotídeos nos genes constituiria informação codificada a qual seria seqüencialmente traduzida para aminoácidos nas proteínas.

      A Replicação do DNA é o processo de auto-duplicação do material genético, concretizando desta forma a transmissão das características hereditárias para gerações futuras.

      Três hipóteses tentaram explicar a replicação do DNA e foram testadas por Mathew Meselson e Franklin Stahl em 1958:

- teoria conservativa: Cada fita do DNA sofre duplicação e as fitas formadas sofrem pareamento resultando num novo DNA dupla fita, sem a participação das fitas "parentais". Assim, fita nova com fita nova formam uma dupla hélice e fita velha com fita velha formam a outra dupla fita;

- teoria semi-conservativa: Cada fita serve de molde para replicar uma nova fita complementar, produzindo duas moléculas de DNA filhas. Cada molécula filha contém duas fitas de DNA com orientação antiparalela. Este processo é chamado de replicação semi-conservativa, porque o par parental é separado em duas metades. A nova molécula filha contém apenas uma fita parental intacta (CHAMPE, 1996);

- teoria dispersivo: Haveria quebras continuadas na espinha-dorsal de açúcar-fosfato e subseqüente reconstituição após a duplicação que poderia resultar numa mistura de segmentos velhos e novos na mesma fita (Bonato, 2003).

      Nos organismos procarióticos a replicação inicia-se em um único ponto, denominada origem de replicação. Nos eucarióticos a replicação inicia em múltiplos pontos ao longo da dupla fita de DNA. Como a molécula de DNA nos eucarióticos é muito comprida, os vários pontos de início possibilitam uma rápida replicação (CHAMPE, 1996).

Desenho digitalizado a partir da figura da página 39 do Livro "Color Atlas of Genetics"de Eberhard Passarge publicado pela Editora Thieme em 1995.

Figura 20: Replicação do DNA em Procariotos. A replicação inicia-se em um ponto do DNA circular e progride até completar todo o genoma (figura disponível no site http://www.assis.unesp.br/egalhard/dna_1.htm, acessado em 26/06/03).


Desenho digitalizado a partir da figura da página 39 do Livro "Color Atlas of Genetics" de Eberhard Passarge publicado pela Editora Thieme em 1995.

Figura 21: Replicação do DNA em Eucariotos. Formação de várias unidades de replicação (replicons). As duas fitas complementares se desenrolam (DNA helicase), conseqüentemente há um aumento de tensão nas fitas do DNA que é corrigido pela DNA topoisomerase (figura disponível no site http://www.assis.unesp.br/egalhard/dna_1.htm, acessado em 26/06/03).


      O início do processo de replicação do DNA é o desenrolamento das fitas seguindo pela separação das duas fitas da dupla hélice parental, por ação de uma enzima denominada DNA helicase. Essa enzima quebra as ligações de pontes de hidrogênio existentes entre as duas bases nitrogenadas das cadeias complementares de nucleotídeos. As fitas complementares permanecem abertas devido a proteínas que se ligam a elas (CHAMPE, 1996).

Figura digitalizada a partir da página 39 do Livro "Color Atlas of Genetics"de Eberhard Passarge publicado pela Editora Thieme em 1995.

Figura 22: Replicação do DNA (figura disponível no site http://www.assis.unesp.br/egalhard/dna_1.htm, acessado em 26/06/03).

      À medida que as duas fitas se separam vai se formando uma região de replicação denominada zona de replicação ou forquilha de replicação e que se move em ambas às direções ao logo da molécula de DNA, durante todo o processo de replicação. Iniciam as replicações em ambas as fitas. Numa fita a replicação acontece de forma contínua e na outra de forma descontínua. A replicação da fita descontínua foi uma incógnita até o experimento realizado por Reiji Okasaki, em 1968, onde pode explicar a incompatibilidade entre a replicação simultânea entre as duas fitas antiparalelas.

Figura 23: Representação da replicação do DNA, como explicar a replicação simultânea de ambas as fitas (figura disponível no site http://www.biologianaweb.com/Livro2/C12/sislac.html, BONATO, M. C. M. Moldes, Módulos e Forma: do DNA às Proteínas, acessado em 26/06/03).

      O processo de replicação envolve a participação de várias enzimas e cofatores que participam processo de replicação do DNA. O início do processo de replicação requer o reconhecimento da região de origem, que é realizado por um grupo de proteínas responsáveis por desenrolar a dupla fita e as manter abertas, o mecanismo para continuar abrindo as fitas é realizado por uma enzima específica, a cópia do molde sintetizando uma nova fita complementar é outra enzima. A seguir a descrição das principais enzimas e suas funções:

- Proteína DnaA – São proteínas que se ligam a seqüência de nucleotídeos específicos na origem da replicação e faz com as fitas de DNA se separem.

- DNA helicase – São enzimas que se ligam a fita simples de DNA, próximo a zona de replicação e se movem na direção da fita dupla, forçando as fitas se separarem e provocando um desenrolamento. Assim que as fitas se abrem as proteínas desestabilizadoras se ligam a fita simples.

- Proteína de ligação do DNA de fita simples –SSB (single strand binding protein) – Estas proteínas denominadas de proteínas desestabilizadoras da hélice, se ligam a fita simples de DNA, mantendo-as separadas.


- DNA topoisomerase – Um problema de superdobramento ocorre a medida que as fitas se separam. As enzimas DNA topoisomerase são responsáveis pelo mecanismo para remover o superdobramento.

- Primase – É a enzima responsável por sintetizar primer. As DNA polimerases não conseguem iniciar a síntese de uma fita complementar de DNA através de um molde completamente composto de fita simples. Elas necessitam de oligonucleotídeo iniciador, denominado primer, que é na realidade uma região curta de aproximadamente 10 nucleotídeos de comprimento, com um grupo hidroxila livre no carbono-3’, que serve como primeiro aceptor de um nucleotídeo.

Figura 24: A DNA polimerase necessita de um primer para iniciar a sintetize de uma nova fita complementar. Este primer é sintetizados por uma RNA polimerase específica denominada primase (figura disponível no site http://www.biologianaweb.com/Livro2/C12/sislac.html, BONATO, M. C. M. Moldes, Módulos e Forma: do DNA às Proteínas, acessado em 26/06/03).

- DNA Polimerase – São as enzimas responsáveis por catalizar o alongamento da cadeia adicionando nucleotídeos um de cada vez, complementar a seqüência das bases nitrogenadas da fita molde. Estas enzimas somente conseguem ler os nucleotídeos da fita de DNA parental na direção 3’ à 5’ e sintetizar novas fitas na direção 5’ à 3’ . Desta maneira, os alongamentos da fitas são em sentidos opostos, porém, o mecanismo não é o mesmo para as duas fitas. A fita que cresce na direção da zona de replicação é sintetizada continuamente, denominada fita líder. A fita que cresce na direção oposta a zona de replicação é sintetizada descontinuamente, copiando pequenos fragmentos de DNA perto da zona de replicação, denominados fragmentos de Okazaki. Estes fragmentos são posteriormente unidos para se tornar uma única fita contínua. A esta fita é denominada de fita atrasada. É extremamente importante para a sobrevivência do organismo que a seqüência dos nucleotídeos sejam replicadas sem erros. Para assegurar esta fidelidade a DNA polimerase possui uma atividade de correção, ou seja, na direção 3’ à 5’, para certificar-se que o nucleotídeo adicionado é de fato complementar a sua base no molde e corrige o erro.


Figura 25: Representação da replicação da fitas de DNA antiparalelas (figura disponível no site http://www.biologianaweb.com/Livro2/C12/sislac.html, BONATO, M. C. M. Moldes, Módulos e Forma: do DNA às Proteínas, acessado em 26/06/03).

- DNA Ligase – É a enzima responsável por realizar a junção entre os fragmentos de DNA (fragmentos de Okazaki) sintetizados na fita atrasada.

      A figura abaixo mostra um modelo de replicação mais completo, expressando a síntese concomitante das fitas líder ou leading (replicação contínua) e fita atrasada ou lagging (replicação descontínua) durante o processo de replicação do DNA, com a participação de várias de toda a maquinaria protéica.

Figura 26: Representação da forquilha de replicação, onde estão mostradas as principais enzimas e cofatores que formam o complexo de replicação (figura disponível no site www.ncbi.nlm.nhi.gov livro The Cell: A molecular Approach, de J. Cooper, Sinauer Assoc. Co.).